Методы оптимизации разрешения пика в ВЭЖХ
Повышение разрешения пиков компонентов пробы, которые элюируются в одинаковых интервалах, — это задача, с которой рано или поздно сталкиваются все хроматографисты. Методы изменения разрешения пиков в ВЭЖХ включают использование коэффициента удерживания, селективности и эффективности колонки.
Использование коэффициента удерживания для оптимизации разрешения
Коэффициент удерживания можно регулировать для оптимизации удерживания путем изменения состава подвижной фазы. Например, при ВЭЖХ с обращенной фазой процентное содержание органического компонента в подвижной фазе следует уменьшить, чтобы увеличить удерживание. Количество тарелок можно увеличить, используя более длинную колонку или колонку, заполненную более мелкими частицами, установив ее на повышенную температуру.
Наиболее эффективно на относительное удерживание двух компонентов можно повлиять, изменяя один параметр метода за раз, например, тип модификатора органического растворителя, используемого в подвижной фазе (ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран).
Использование избирательности для оптимизации разрешения
Правильный выбор стационарной и подвижной фаз имеет решающее значение для достижения наилучшей селективности хроматографических пиков.
В обращенно-фазовой хроматографии мы разделяем аналиты между полярной подвижной и неполярной неподвижной фазами (противоположность нормально-фазовой хроматографии). Обычно мы добиваемся неполярного, неспецифического взаимодействия аналитов с гидрофобной неподвижной фазой. Это означает, что образец разделяется на стационарную фазу, такую как C18, C8, фенил или C3, что дает различение полярности или различение на основе ароматической структуры.
В обращенно-фазовой хроматографии более полярные аналиты задерживаются в меньшей степени, чем неполярные. Удерживание примерно пропорционально гидрофобности аналитов. Поэтому аналиты с большими гидрофобными группами и более длинными алкильными цепями будут лучше удерживаться, чем молекулы с полярными группами в своей структуре. Если у вас есть ряд жирных кислот, таких как C12, C14, C16 и C18, то C12 будет удерживаться в наименьшей степени, а C18 — в наибольшей степени.
Теперь рассмотрим подход к разработке метода обращенно-фазовой хроматографии. Во-первых, вы должны выбрать размер пор, чтобы молекулы проникали в материал и взаимодействовали с гидрофобной неподвижной фазой внутри пор.
Далее необходимо выбрать неподвижную фазу. Большинство начинают с фазы C18. В зависимости от цели вашего метода как правило выбирают обычные колонки https://lab-support.ru/katalog/item/xchroma_C18_5_4_6_250/ или колонки быстрого анализа
Вы должны выбрать фазу, которая соответствует требованиям образца. При работе с небольшими гидрофобными молекулами подойдет алкильная фаза с более длинной цепью, такая как C18, если удерживание не слишком сильное. Фазы C8 обычно обладают такой же селективностью, что и фаза C18, но демонстрируют несколько более низкое удерживание. Для очень гидрофобных молекул предпочтительно использовать фазу с очень короткой цепью, такую как C3. Если молекулы аналита имеют ароматический характер и не могут быть достаточно разделены на алкильной фазе, можно использовать связанную ароматическую фазу, такую как фенил или дифенил.
Использование эффективности колонки для оптимизации разрешения
Еще одна переменная для изменения разрешения пиков в ВЭЖХ использует эффективность колонки. Колонки, заполненные очень мелкими частицами, или очень длинные колонки могут обеспечить высокую эффективность и увеличить пиковую емкость колонки.Теоретически можно использовать очень длинные колонки, заполненные более мелкими частицами при повышенных температурах, чтобы максимизировать разрешение. Однако на практике это приводит к увеличению времени анализа. Типичный подход хроматографистов состоит в том, чтобы сбалансировать потребность в разрешении с ограничениями по скорости и давлению в системе. Таким образом, тенденция заключается в использовании колонок меньшей длины и меньшего размера частиц при повышенных температурах, что уравновешивает разрешение, скорость и противодавление. Такие поставщики расходных материалов для хроматографии, как Lab-Support, могут обеспечить все ваши потребности в расходных материалах, чтобы максимально увеличить пиковое разрешение.