Блог

Поменял колонку 250 × 4,6 мм на 250 x 4,0 мм, на хроматограмме появился горб, что делать?

Вопрос: Я использую изократический метод, размер колонки 250 × 4,6 мм, размер частиц 10 мкм, подвижная фаза – 20% ацетонитрил (ACN)/буфер, скорость 1 мл/мин. Я растворяю свой образец в ACN и произвожу инжекцию. Обычно нужная мне субстанция элюируется через 7,7 мин. Я перешел на колонку размером 250 x 4,0 мм (остальные параметры остались без изменений), но теперь на переднем фронте пика появился отчетливый горб. Это другое соединение или я делаю что-то не так? 

Ответ: Если вы меняете диаметр колонки, следует изменить и все объемные параметры, приведя их в соответствие с площадью ее поперечного сечения. В вашем случае это будет (4,0/4,6) 2 = 0,756 ≈ 75%. Иными словами, если вы уменьшите скорость потока на 25% до 0,75 мл/мин, то значения времени удержания и давления в системе останутся прежними. Вы также сэкономите 25% мобильной фазы (и ее стоимости), что, по-видимому, также стоит того, чтобы произвести эти изменения хотя бы только ради экономии. 

Image description

Как правило, это небольшое изменение объема колонки не должно влиять на форму пика. Однако в вашем методе есть один красный флажок, и это растворитель для инжекций. Как правило, вы можете вводить до ≈15% объема пика без заметного расширения полосы ... но это если вы вводите в подвижной фазе. Поскольку растворитель для инжекций является более концентрированным, чем подвижная фаза, вы должны быть осторожны. 100% растворитель для инжекций ACN и 20% мобильная фаза CAN – я подозреваю, что именно это и есть источник ваших проблем. Судя по предварительной оценке, объем интересующего вас пика составляет около 350 мкл. Это означает, что при инжекции в мобильной фазе вы должны вводить около 50 мкл в колонку диаметром 4,6 мм.

При диаметре колонки 4,0 мм это количество уменьшается до 40 мкл. Во избежание проблем при инжекции со 100% ACN, я думаю, вам следовало бы вводить не более 20 мкл. 

Итак, судя по той информации, которую вы мне дали, я могу предположить, что вы вводите слишком много слишком сильного растворителя. Расщепление пика является классическим симптомом этой проблемы. Почему это происходит при работе с колонкой 4,6 мм? По-видимому, на этой колонке вы как раз находитесь на границе расщепления пика, и здесь достаточно самого небольшого уменьшения объема колонки. Самый простой способ проверить мое предположение – сделать серию инжекций (50, 40, 30, 20, 10 и 5 мкл) в 100% ACN. Если мои подозрения верны, при меньшем инжектируемом объеме форма пика улучшается и увеличивается число теоретических тарелок (т.е. получается более узкий пик). Было бы хорошо удвоить «запас прочности» метода: если при 40 мкл все идет нормально, вводите 20 мкл. 
____________________
На основании материалов форумов Separation Science HPLC Solutions

Сообщить о нарушении