1. Проблемы, связанные с хроматографической колонкой ВЭЖХ и вне колонки.

• Хвост хроматографического пика: он связан с колонкой, скоростью потока подвижной фазы, образцом и т. д., и причина появления хвоста должна быть найдена с учетом этих аспектов.
• Как продлить срок службы хроматографической колонки: техническое обслуживание очень важно. Замочите ее в метаноле, если она не используется в течение длительного времени. Строго контролируйте время промывки колонки или объем растворителя для промывки колонки. Как правило, вы должны использовать метанол (или воду: метанол в соотношении 20:80) для промывки в течение 45 минут или в 20 раз больше объема слоя.
• Следует обратить внимание на контроль «внеколоночных эффектов». Так называемый «эффект дополнительной колонки» относится к эффекту расширения хроматографического пика, вызванному мертвым объемом трубки, соединений, инжектора и проточной кюветы в дополнение к системе колонок в системе ВЭЖХ.
• Отбор проб: во время автоматического отбора проб следует часто проверять автодозатор, а инструментальный инжектор должен быть стабильным и надежным; при ручном отборе проб особое внимание следует уделять деталям отбора проб и ощущениям. 

2.Качество колонки для ВЭЖХ

• Эффективность хроматографической колонки: чем больше количество тарелок, тем лучше, и особое внимание следует уделять факторам, влияющим на эффективность колонки. Колонка выбрасывается, когда количество тарелок падает до определенной нижней границы.
• Повторяемость: когда колонка используется повторно, максимальное относительное стандартное отклонение может поддерживаться на уровне менее 0,1%.
• Долговечность (срок службы): поскольку эффективность колонки легко снижается, необходимо уделить внимание защите колонки.
• Хроматографическую колонку необходимо очищать после использования во избежание коррозии, засорения и сокращения количества тарелок. Как правило, его следует промывать объемом, в 20 раз большим объема пробы. ВЭЖХ, которая используется каждые несколько дней, следует промыть смесью 20% метанола: 80% воды в течение примерно 30 минут, а затем промыть чистым метанолом в течение 20 минут перед хранением.

3. Проблемы с подвижной фазой

• Значение pH особенно важно: обычно, когда покупают колонки C18 с pH меньше 3, легко повредить хроматографическую колонку, но небольшое значение pH можно использовать для кислотоустойчивых колонок.
• Пожалуйста, обратите внимание на выбор длины волны отсечки реагента: например, длина волны отсечки ацетонитрила 215 нм, длина волны отсечки ацетона 330 нм, н-бутан 210 нм и т. д.
• Скорость потока: Скорость потока должна быть подходящей, в противном случае будет нарушена форма пика и растворитель будет потрачен впустую. Обычно для рутинного анализа выбирается скорость 1 мл/мин.

4. Предварительная обработка растворителем

Лучше всего использовать высококачественные растворители для ВЭЖХ, которые перед использованием необходимо отфильтровать и дегазировать. Обратите внимание на следующее:

• Растворитель должен быть отфильтрован для удаления мельчайших частиц и микроорганизмов, содержащихся в растворителе, перед подачей в насос и перед вводом пробы, чтобы гарантировать, что насос и хроматографическая колонка не будут заблокированы или повреждены, а аналитические данные должны быть надежными.
• Общие требования к фильтру: высокая скорость, малая скорость растворения, малый мертвый объем, точный размер пор, надлежащий объем, хорошая химическая совместимость и т. д.

Для метода выбора размера пор: если диаметр насадки колонки меньше 3 мкм или стерильная фильтрация, обычно решают купить шприцевые фильтры с размером пор 0,22 мкм ; если диаметр насадки колонки больше 5 мкм, выберите с диаметром 0,45 мкм ; если предварительная фильтрация или фильтрация затрудняют фильтрацию образцов, обычно выбирают шприцевые фильтры с диаметром пор 1 мкм. Особенно для буферов, приготовленных с неорганическими солями, вы должны уделять больше внимания выбору правильного фильтра. В противном случае получить достоверные данные анализа и испытаний невозможно.

• Дегазация:

  Основной целью является удаление пузырьков, растворенных в подвижной фазе или образовавшихся при перемешивании. Наиболее часто используемая дегазация подвижной фазы в жидкостной хроматографии - это автономная ультразвуковая вибрационная дегазация, интерактивная дегазация с продувкой барботированием инертного газа и оперативная вакуумная дегазация. Пузырьки воздуха в подвижной фазе, попадающие в насос жидкой фазы, вызывают колебания давления, которые очень вредны и должны быть устранены. Дренажный клапан можно открыть для промывки при высокой скорости потока. 

5. Буферный раствор

• Буфер необходимо отфильтровать перед использованием.
• Растворители и образцы восприимчивы к бактериям и плесени, поэтому очищайте их.
• Как правило, органические растворители нельзя использовать непосредственно для очистки и промывки.
• Для градиентного элюирования выберите буфер с низким значением поглощения, например: при градиентном элюировании буфер предварительно смешивают с органическим веществом, чтобы предотвратить осаждение солей. При условии, что пик не имеет хвоста, используйте как можно более низкую концентрацию буферной соли, чтобы предотвратить осаждение соли; концентрация буферной соли обычно составляет 20 ~ 30 мМ.

Если содержание органической фазы в подвижной фазе высокое, концентрация солевого буфера в подвижной фазе не должна быть слишком высокой, а концентрация соли должна, по крайней мере, гарантировать, что она не будет осаждаться в условиях подвижной фазы. Концентрация ионно-парного буфера должна быть выше, обычно 50-100 мМ.

6. Очистка форсунки

Для инжектора или иглы для инъекций обратите внимание на три момента:

• Требования к пробоотборнику: автоматический ввод пробы и высокая скорость отбора проб, некоторым приборам для отбора проб требуется всего 17 секунд.
• Камера для отбора проб требует контроля: обычно используется охлаждение Пельтье, а диапазон контроля температуры составляет 4 ℃-100 ℃.
• Особое внимание следует уделить промывке иглы после вкола для удаления оставшихся частиц инъекций.